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    Odyssey On/In-Cell Western技術助力篩選下調PD-L1表達的激酶抑制劑

    版權所有,轉載請聯系基因市場部
    2020-12-16

    蛋白激酶已成為許多疾病中重要的細胞調節蛋白。激酶直接或間接控制大多數細胞過程,包括代謝,轉錄,細胞周期進程,細胞骨架重排,細胞凋亡和分化,信號傳導等。因此,蛋白激酶已逐漸成為藥物開發的主要目標,其中激酶抑制劑已成為治療癌癥最重要的藥物之一。

     

    程序性死亡-1(PD-1)與其配體(PD-L1)的相互作用是一個重要的免疫檢測點,在臨床上,用抗PD-L1抗體阻斷PD-1/PD-L1相互作用具有良好的抗腫瘤活性。但是,抗體阻斷只對一小部分患者有用。近年來,小分子激酶抑制劑被廣泛應用于抗腫瘤藥物,有多種激酶抑制劑被報道抑制PD-L1的表達。然而,PD-L1表達與激酶抑制劑之間的關系還沒有完全闡明。因此,研究激酶抑制劑治療與PD-L1/PD-1阻斷的相關性將是一個有趣的問題。本文作者基于Odyssey On/In-Cell Western (O/ICW),建立了一個新的、強大的篩選系統,用于識別下調腫瘤細胞PD-L1水平的激酶抑制劑,具有較高的靈敏度,結果更精確,通量更高,重復性更好,方便快捷。除激酶抑制劑外,該篩選系統還可用于篩選其他類型的小分子,例如可有效篩選下調PD-L1表達的合成化合物或天然產物等。

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    在HT-1080細胞系中建立基于Odyssey On /In-Cell Western的檢測方法篩選PD-L1的下調劑

    為了評價激酶抑制劑對PD-L1在細胞膜上表達的影響,作者用Odyssey On/In-Cell Western建立了篩選系統。首先,尋找一個PD-L1高表達水平的細胞系,通過免疫印跡的方法分析了包括DU-145、PC-3、22RV1、HT-1080、H1299、H1975、H-460、A-549和HeLa等多個癌細胞系中PD-L1蛋白水平,結果表明HT-1080細胞株的PD-L1蛋白水平明顯高于其他細胞系(圖1a)。另外,HT-1080對聚苯乙烯具有良好的附著力,適合在96孔板中培養。因此,作者選擇HT-1080建立Odyssey On/In-Cell Western分析方法。然后,為了驗證Odyssey On/In-Cell Western分析的有效性,作者使用western blot(圖1b)和Odyssey On/In-Cell Western分析(圖1c)比較HT-1080和PC-3的PD-L1水平。結果表明,HT-1080的PD-L1水平遠高于PC-3,說明所建立的Odyssey On/In-Cell Western篩選系統是可靠的。另外,據報道IFN-γ可誘導PD-L1的表達,而CDK5抑制劑則會導致PD-L1的減少。因此,作者進一步使用IFN-γ和dinaciclib(一種有效的CDK5抑制劑)來評估Odyssey On/In-Cell Western篩選系統。Odyssey On/In-Cell Western實驗結果(圖1e),表明IFN-γ能有效地提高HT-1080中PD-L1的水平,dinaciclib能顯著抑制PD-L1的表達,這與以往的報道一致,與western blot(圖1d)的結果相當。綜上所述,表明已建立的Odyssey On/In-Cell Western篩選系統可以方便地用于鑒定抑制細胞表面PD-L1表達的小分子。

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    圖1:建立用于檢測HT-1080細胞中PD-L1表達下調的Odyssey On/In-Cell Western篩選系統

    Odyssey On /In-Cell Western法篩選激酶抑制劑庫

    使用Odyssey On/In-Cell Western篩選系統來檢測小分子激酶抑制劑對HT-1080細胞系細胞表面PD-L1表達的影響。對激酶抑制劑庫進行篩選,其中包括430種靶向具有高結構多樣性的激酶庫的抑制劑??紤]到激酶抑制劑的潛在細胞毒性,分別用10 nM、100 nM、1μM和10μM的不同劑量篩選文庫,僅收集細胞毒性可忽略的用量進行進一步分析。根據抑制劑治療組β-actin的熒光強度與DMSO對照組熒光強度的比值來評價小分子的細胞毒性。如果比值小于0.5,我們認為抑制劑具有嚴重的細胞毒性(圖2a)。然后,選擇了與對照組(DMSO)相比,能夠使PD-L1表達降低20%以上的小分子激酶抑制劑,在1μM和10μM用量下分別有43種和59種小分子激酶抑制劑使細胞表面PD-L1降低(圖2b,c)。共有102種抑制劑可導致PD-L1降低20%以上,占激酶抑制劑總量的23.7%,從而突顯了蛋白激酶與PD-L1表達調控之間的緊密聯系。

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    圖2:基于Odyssey On/In-Cell Western的高通量篩選用于抑制HT-1080細胞表面上PD-L1表達的小分子

    通過Odyssey Western Blot確認PD-L1下調的激酶抑制劑

    篩選到的抑制劑根據其作用功能被進一步分到不同的激酶組,對于每一組,選擇一個代表做進一步確認。選擇了28種可降低細胞表面PD-L1表達的小分子激酶抑制劑進行Odyssey Western Blot分析。將PD-L1的整合熒光強度與β-actin的整合熒光強度進行均一化,將對照組(DMSO組)設為100%。結果表明,約有18個化合物對PD-L1的表達具有抑制作用,其作用靶點包括MEK、EGFR、AKT和ATM等。

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    圖3:用Odyssey Western Blot法檢測HT-1080細胞PD-L1的表達

    所選激酶抑制劑的流式檢測

    由于PD-L1是一種跨膜蛋白,它通過其胞外結構域與PD-1相互作用在細胞膜上發揮作用。因此,作者進一步用流式細胞術檢測細胞膜上PD-L1的水平。14種激酶抑制劑(包括Cobimetinib、AT7519、Lapatinib、ERK5-in-1、LY2090314、vaccinol-1、GSK2334470、Uprosertib、KU-60019、ZM447439、FIIN-2、CYT387、Fingolimod、Fostamatinib)均能明顯降低細胞膜PD-L1的水平,且大部分與Odyssey Western Blot結果一致。

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    圖4:流式細胞儀檢測HT-1080細胞PD-L1的表達

    協同作用評價實驗

    用Odyssey Western Blot法進一步評估了HT-1080細胞中ATM抑制劑(KU-60019),MEK抑制劑(Cobimetinib)和JNK抑制劑(Vacquinol-1,MKK4激活劑)對PD-L1的協同抑制作用。用KU-60019和Vacquinol-1共同處理HT-1080細胞后,PD-L1的表達水平顯著降低。而KU-60019與Cobimetinib共處理或KU-60019與Cobimetinib共處理的抑制效果沒有明顯的協同作用(圖5a,b)。接下來,作者在H460細胞中測試了這三對化合物的協同效應,得到了相似的結果(圖5c,d)。只有KU-60019和Vacquinol-1聯合處理對PD-L1的表達有顯著的協同抑制作用。

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    圖5:ATM抑制劑、MEK抑制劑和MKK4激活劑協同下調HT-1080細胞和H460細胞PD-L1


    總之,在本文中,作者建立了一種Odyssey On/In-Cell Western分析法來評估PD-L1在細胞表面的表達水平。這種基于細胞的檢測結合了Western Blotting的特異性和ELISA的重復性和高通量,可以快速定量監測細胞表面蛋白的表達。與WB相比,Odyssey On/In-Cell Western的優勢在于其高通量的能力,更高的精度以及減少的樣品制備要求。Odyssey On/In-Cell Western對于低數量的樣本或需要大量樣本的流程可能會提供更好的靈敏度和精度。并且建立的Odyssey On/In-Cell Western篩選系統被證明是評估PD-L1蛋白質水平的一種強大、便捷的方法。除篩選激酶抑制劑外,還可用于篩選其他類型的小分子,如合成化合物或天然產物等。

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    On/In-Cell Western是由LI-COR公司研發的一種直接在微孔板內(96/384孔板)對細胞內目標蛋白進行定量免疫熒光檢測的方法。On/In-Cell Western無需進行裂解細胞、制膠、電泳、轉膜等步驟,不僅節省了大量時間,而且大大提升了實驗通量和重復性,能更好地助力激酶信號通路和藥物功效檢測。

    微孔板內的細胞經過固定、透化、一抗、二抗孵育、洗滌等步驟后,即可在Odyssey雙色紅外激光成像系統上對微孔板進行掃描成像,實現對細胞內目標蛋白的精確定量。

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    基因有限公司作為LI-COR產品中國區代理商,與LI-COR一起邀請您關注近紅外熒光成像技術在Western Blot準確定量、磷酸化等蛋白修飾化研究、In-Cell Western、雙色EMSA、蛋白芯片及光免疫療法等方面的應用進展。欲進一步了解詳細內容,請關注我們的官方微信“基因快訊”或聯系您身邊的基因有限公司工作人員。

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    參考文獻:

    [1] Xie Y , Ding J , Cui X , et al. Screening of kinase inhibitors downregulating PD-L1 expression via on/in cell quantitative immunoblots[J]. European Journal of Pharmaceutical ences, 2019, 142:105088.


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