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      細胞樣本中病毒滴度檢測和抗病毒藥物篩選,選用 In-cell western 技術就對了

      版權所有,轉載請聯系基因市場部
      2020-04-21

      對于研究病毒的科研人員來說,了解病毒的感染特性是至關重要的。例如引起COVID-19的冠狀病毒SARS-CoV-2,標準菌斑分析法(SPA) 是研究病毒感染特性和病毒滴度的傳統方法。但該方法存在一定的局限性,操作繁瑣,通量低,無法準確定量,并且容易引入認為誤差。

            In-Cell Western技術,是一種依據抗原抗體結合原理,利用目標蛋白的特異性抗體及近紅外熒光染料標記的二抗,在96孔板或384孔板培養的細胞上原位對目標蛋白進行定量分析的技術。該技術結合了 Western blot 技術的特異性與 ELISA 技術的可復制性和通量,目前已成為研究病毒感染特性的高效、快速、可靠的實驗技術。



      In-cell western 技術原理與實驗流程


      In-cell western 技術可監測細胞感染的HSV-1病毒

      在96孔細胞培養板中用不同滴度的 HSV-1 病毒感染 Vero 細胞,完成細胞固定和一抗孵育后,使用LI-COR 近紅外熒光二抗孵育,更后用 Odyssey 近紅外成像系統檢測熒光信號。不僅可以通過熒光信號強度判斷細胞所感染的病毒滴度,而且可以根據熒光信號的位置鎖定病毒感染部位。標準菌斑分析法(SPA)佐證了 In-cell western 實驗結果的準確性 。


      In-cell western 技術可對細胞感染的 HSV-1 病毒進行準確定量


      SPA 法僅可對較低滴度的 HSV-1 感染的細胞中的病毒進行粗略定量,且需要稀釋病毒,誤差較大,過程繁瑣,通量低,對于較高滴度的病毒無法計數。In-cell western 技術則可直接對感染高滴度病毒的細胞中的HSV-1 進行檢測,無需稀釋,通量高,速度快,定量準確。



      In-cell western 技術適用于抗 HSV-1 病毒藥物的篩選


      預先使用不同濃度梯度的抑制HSV-1病毒復制的ACV藥物處理Vero細胞,然后用 0.1, 0.5 和 1m.o.i. HSV-1 感染細胞,通過對病毒感染早期的ICP4 蛋白和感染晚期的gB蛋白的定量來判斷ACV藥物的效果,Cell-Tag 700 熒光染料對細胞進行染色起到均一化細胞數量的作用。




      In-cell western 技術優勢

      01

      省時,直接在微孔板檢測,無需細胞裂解、跑膠和轉膜等過程

      02

      高通量,一次可實現96/384個樣品檢測

      03

      數據變異小,直接對細胞內的蛋白進行檢測,特異性好,靈敏度高

      04

      雙通道同時檢測,不同熒光標記二抗同時檢測兩個蛋白




      In-cell western 應用廣泛

      高通量快速的In-Cell Western已廣泛應用到細胞自噬、凋亡、癌癥、藥物研究、信號轉導、離子通道、基因表達等多個方面。更多應用文獻請登錄 LI-COR 官網查詢:https://www.licor.com/bio/publications/


      參考文獻
      Weldon, S.K., et. al. (2010). Journal of Virological Methods, 168(1–2), 57–62. DOI: 10.1016/j.jviromet.2010.04.016
      Fabiani, M., et. al. (2017). Frontiers in Microbiology, 8(1085). DOI: 10.3389/fmicb.2017.01085
      DuShane, J.K., et. al. (2019). Frontiers in Microbiology, 10(783). DOI: 10.3389/fmicb.2019.00783
      Ma, H. W., et. al. (2017). Frontiers in Cellular and Infection Microbiology, 7(269). DOI: 10.3389/fcimb.2017.00269
      McCormick, D. et. al. (2018). mBio, 9(3), e00716-18. DOI: 10.1128/mBio.00716-18
      Sklan, E. H. et. al. (2007). Journal of Virology, 81(20), 11096–11105. DOI: 10.1128/JVI.01249-07



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